Pengkajian Keamanan Lingkungan Vaksin Circoflex

Ingelvac^®CircoFLEX adalah sediaan vaksin yang diproduksi oleh Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc, USA dan akan didaftarkan untuk diedarkan di Indonesia oleh PT. Boehringer Ingelheim Indonesia.

Vaksin ini mengandung sub unit protein Open Reading Frame 2 (ORF2) dari Porcine Circo Virus tipe 2 (PCV2) (paten BoehringerInge lheim dengannomor US 7,700,285 B1), strain Struve 7-20-99 (Eichmeyer.,et al, 2010), yang diekspresikan oleh Baculovirus (BaculoGold^TM DNA) yang merupakan derivat dari Autographa californica Nucleopolyhedroviruses (AcNPV) wild-type. Protein rekombinan ini telah dipurifikasi dengan dua kali filtrasi (pre-filter 2-15 µm dan final filter 0.8-1.0 µm) dan diinaktifasi dengan Binary Ethylenimine (BEI). Oleh karena itu sediaan ini tidak mengandung virus hidup.

Selama ini vaksin Porcine Circo Virus Assciated Disease (PCVAD) yang terdaftar di Indonesia sejak tahun 2010 menggunakan virus circokonvensional. Penerapan teknologi rekayasa genetik dengan menggunakan Baculovirussebagai inang jasad renik yang disisipkan gen ORF2 PCV2 sudah banyak dimanfaatkan dalam industri vaksin di dunia, akan tetapi produk teknologi ini belum beredar di Indonesia. Dibeberapa negara Eropa (misal: Jerman, Perancis, Denmark, Itali, Inggris),Rusia, beberapa negara di Amerika (USA, Argentina, Brazil, Colombia, dll), dan Asia (Jepang, Korea, Malaysia, China, Thailand, Philipina, Vietnam, dll), vaksin sub unit ORF2PCV2 Baculovirus sudah terdaftar dan beredar (cerificate of free sale).

Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup Nomor 25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH-PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan terhadap vaksin Ingelvac^® CircoFLEX. Pengkajian didasarkan atas informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas inang alami dari tetua jasad renik PRG, sifat genetik yang telah direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, dan kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG untuk vaksin terhadap lingkungan. Selengkapnya klik disini

Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Ingelvac^®CircoFLEX

  I.    Pendahuluan

Ingelvac^®CircoFLEX adalah sediaan vaksin yang diproduksi oleh Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc, USA dan akan didaftarkan untuk diedarkan di Indonesia oleh PT. Boehringer Ingelheim Indonesia.

Vaksin ini mengandung sub unit protein Open Reading Frame 2 (ORF2) dari Porcine Circo Virus tipe 2 (PCV2) (paten BoehringerInge lheim dengannomor US 7,700,285 B1), strain Struve 7-20-99 (Eichmeyer.,et al, 2010), yang diekspresikan oleh Baculovirus (BaculoGold^TM DNA) yang merupakan derivat dari Autographa californica Nucleopolyhedroviruses (AcNPV) wild-type. Protein rekombinan ini telah dipurifikasi dengan dua kali filtrasi (pre-filter 2-15 µm dan final filter 0.8-1.0 µm) dan diinaktifasi dengan Binary Ethylenimine (BEI). Oleh karena itu sediaan ini tidak mengandung virus hidup.

Selama ini vaksin Porcine Circo Virus Assciated Disease (PCVAD) yang terdaftar di Indonesia sejak tahun 2010 menggunakan virus circokonvensional. Penerapan teknologi rekayasa genetik dengan menggunakan Baculovirussebagai inang jasad renik yang disisipkan gen ORF2 PCV2 sudah banyak dimanfaatkan dalam industri vaksin di dunia, akan tetapi produk teknologi ini belum beredar di Indonesia. Dibeberapa negara Eropa (misal: Jerman, Perancis, Denmark, Itali, Inggris),Rusia, beberapa negara di Amerika (USA, Argentina, Brazil, Colombia, dll), dan Asia (Jepang, Korea, Malaysia, China, Thailand, Philipina, Vietnam, dll), vaksin sub unit ORF2PCV2 Baculovirus sudah terdaftar dan beredar (cerificate of free sale).

Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup Nomor 25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH-PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan terhadap vaksin Ingelvac^® CircoFLEX. Pengkajian didasarkan atas informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas inang alami dari tetua jasad renik PRG, sifat genetik yang telah direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, dan kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG untuk vaksin terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan dibawah ini.

II.   Informasi Jasad Renik

II.1. Deskripsi Umum Jasad Renik

Jasadrenik PRG yang digunakan untuk memproduks ivaksin Ingelvac^®CircoFLEX adalah Baculo virus rekombinan sebaga iinang yang disisipi gen ORF2PCV2, strain Struve 7-20-99 sebagai gen donor.

II.2. Informasi Sifat Genetik Jasad Renik

TetuajasadrenikPRG (BaculoGold^TM DNA)adalahAutographa californica Nucleopolyhedroviruses (AcNPV) wild-typeyang telah dimodifikasi agar mengandung lethal deletion. Inang alami Baculovirus adalah insekta Autographa californica. Baculovirus secara umum tidak dapat menginfeksi ataupun menimbulkan penyakit pada manusia dan mamalia lain (Volkman et.al.,1983).

Sebagai donor gen adalah ORF2PCV2 strainStruve 7-20-99, nomor akses JA039636.1((Eichmeyer., et al, 2010),) yangdisisipkan kedalam genome Baculoviruspada bagian “engineered deletion”dari gen polyhedrin BaculoGold^TM DNA.Jasad renik rekombinan ini kemudian diberi nama Baculovirus rekombinan ORF2 PCV2, nomor akses JA039637.1 dan dipatenkan oleh Boehringer Ingelheim Vetmedica dalam Patent Application Publication No. US 7,700,285 B1 tanggal 20 April 2010, (Eichmeyer.,et al, 2010).

Baculovirusrekombinan ORF2 PCV2 telah diuji stabilitas genetiknya dengan metode PCR-RFLP sampai dengan 4 kali pasase. Hasil uji membuktikan bahwa Master Seed Virus (MSV) dan Working Seed Virus (WSV) secara genetik sama, tidak ada perubahan genetik setelah beberapa kali pasase(BIV, 2004).

II.3. Metoda Konstruksi Genetik

Konstruksi genetik dari rekombinan BaculovirusORF2 PCV2 telah dipatenkan oleh Boehringer Ingelheim Vetmedica dalam “Patent Application Publication” No. US 7,700,285 B1, (Eichmeyer.,et al, 2010).Secara singkat konstruksi genetik dirangkum dalam memoInternational regulatory affairs, USA,sebagai berikut:

1. Genom PCV2 diekstraksi dari supernatan kultur sel PK-15 yang telah diinokulasi dengan virus PCV2. Fragmen ORF2PCV2 yang menyandi kapsid protein PCV2 diamplifikasi dengan PCR menggunakan primerposisi 5’end pada konsensus Kozaksekuen dan 3’end pada posisirestrictionEcoRI, menghasilkan amplikon 713bp.
2. ORF2PCV2 hasil PCR dikloning kedalam vektor Promega pGEM-T-Easy. Fragmen ORF2PCV2 dalam rekombinan pGEM-T-Easy didigesti dengan enzim NotI dan disub-kloning kedalam promotor polyhedrin-transfer vector, pVL1392 menjadi N47-064Y. Rekombinan ini di ko-transfeksi kedalam sel insekta dan melalui proses rekombinasi homolog akan menghasilkan Baculovirus rekombinan.
3. Hasil akhirnya adalah ORF2PCV2 Baculovirusyang mengandung Baculovirus rekombinan yang merupakan gen ORF dari strain PCV2 asal Amerika Utara. Gen ORF2PCV2 ini berada dibawah kontrol polyhedrin promotor.

II.4. Karakter Modifikasi Genetik

Baculovirus rekombinanORF2 PCV2 merupakan Baculovirus Autographa californica Nucleopolyhedroviruses(AcNPV) yang mendapat sisipan gen ORF2 PCV2 dari circovirus strain Struve 7-20-99.

Modifikasi genetik ini tidak mengubah gen interestORF2 PCV2. Hal ini berdasarkan hasil uji perbandingan sifat genotipedan fenotipedari ORF2 PCV2Baculovirus dibandingkan dengan ORF2 PCV2 “wild type” dan telah dipatenkan oleh Boehringer Ingelheim didalam US Patent Application Publication Nomor: US 2011/0020394 A1, (Vaughn, E., et al. 2011),secara singkat sebagai berikut; Fenotipe Baculovirus rekombinanORF2 PCV2 berbeda dengan Baculovirus tetuanya karena mengekspresikan protein ORF2 dari PCV2. Protein rekombinanORF2PCV2 yang diekspresikan oleh Baculovirus rekombinanORF2 PCV2 tidak berbeda dengan ORF2 yang diekspresikan oleh PCV2 wild type, melalui analisis SDS-PAGE dan Western Blot. (Vaughn, E., et al, 2011).

II.5. Kemungkinan terjadinya ketidakstabilan gen yang disisipkan sehingga dapat dipindahkan ke organisme lain

       Gen yang disisipkan ke dalam Baculovirus rekombinanORF2 PCV2 bersifat stabil sesuai dengan penjelasan yang terdapat pada butir II.2.

Disamping itu, untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen donor ORF2 PCV2 ke organisme lain, maka telah dilakukan Blast nukleotida dariORF2 PCV2 (strain Struve 7-20-99) milik Boehringer Ingelheim dengan nomor PatenUS 7,700,285 B1, GenBank: JA039636.1, (Eichmeyer.,et al. 2010).

Berdasarkan hasil Blastnukleotida tidak ditemukan adanya homologi sekuen ORF2 PCV2 pada organisme lain, sehingga dapat disimpulkan bahwa pemindahan gen dari jasad renik PRG ke organisme lain kemungkinannya sangat kecil bahkan tidak ada. Disamping itu sediaan produk akhir sudah tidak mengandung jasad renik PRG dari Baculovirus rekombinanORF2 PCV2.

II.6. Kesimpulan

Berdasarkan pengkajian informasi genetik jasad renik PRG dalam vaksin dapat disimpulkan bahwa:

1. Vaksin Ingelvac^® CircoFLEX merupakan vaksin sub unit yang mengandung protein ORF2 PCV2 yang diekspresikan olehBaculovirus rekombinan.
2. Baculovirus rekombinan ORF2 PCV2 bersifat stabil secara genotipe dan fenotipe.
3. Tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen ORF2 dari PCV2 dalam Baculovirus rekombinan ORF2 PCV2 ke organisme lain.

III. InformasiKeamananLingkungan

III.1.KemampuanPenyebaranJasadRenik PRG dalamVaksin

Didalam sediaan produk akhir vaksin sudah tidak mengandung jasad renik PRG dari Baculovirus rekombinanORF2 PCV2.Hal ini karena di dalam proses produksi protein ORF2,supernatanBaculovirus rekombinan telah mengalami proses filtrasi (pre-filter 2-15 µm dan final filter 0.8 – 1.0 µm) dan inaktifasidengan Binary Ethylenimine (BEI) sehingga produk akhir yang dihasilkan adalah protein murni dari ORF2. Protein tersebut merupakan materi inaktif yang tidak memiliki kemampuan untuk melakukan penyebaran jasad renik ke lingkungan. Diagram alur proses produksi vaksin terdapat pada Eichmeyer.,et al. 2010.

Berdasarkan hal tersebut maka dapat dinyatakan bahwa vaksin Ingelvac^® CircoFLEX tidak memiliki kemampuan untuk menyebarkan jasad renik ke lingkungan. Hal ini karena produk akhir vaksin hanya merupakan sub unit protein bukan organisme utuh, sehingga bersifat inaktif dan tidak memiliki kemampuan untuk menimbulkan shedding virus untuk menginfeksi/menyebarkan jasad renik ke organisme hidup lain dilingkungan.

III.2. Informasi Cakupan Inang Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin

Hospes alami dari Baculovirus yang digunakan dalam vaksin ini adalah insekta bernama Autographa californica. Hewan ini merupakan kelompok hewan arthropoda dari ordo Lepidoptera.

III.3. Informasi Kajian Molekuler

Sifat genetik yang direkayasa adalah genom dari Baculovirus yang disisipi gen ORF2 PCV2. Konstruksi gen ORF2 PCV2 rekombinan menggunakan plasmid pGEM-T-Easy. Insersi gen ORF2 PCV2 ke genom Baculovirus menggunakan vektor transfer pVL1392, menjadi Baculovirus rekombinan ORF2 PCV2 yang mengekspresikan protein ORF2. Protein rekombinan ORF2 dimurnikan dengan filtrasi bertingkat dan diinaktifasi dengan BEI sehingga diperoleh protein ORF2 murni dan inaktif yang aman bagi lingkungan.

III.4. Kemungkinan Risiko Jasad Renik PRG dalam Vaksin Terhadap Lingkungan.

Vaksin Ingelvac^® CircoFLEX tidak memiliki potensi untuk melakukan penyebaran jasad renik ke lingkungan,karena dalam sediaan produk akhir vaksin sudah tidak mengandung jasad renik PRG. Didalam proses produksinya,supernatankultur Baculovirus rekombinan telah mengalami proses filtrasi bertingkat dan diinaktifasi dengan BEI sehingga diperoleh protein ORF2 murni dan inaktif.Protein tersebut tidak berpotensi menyebarkan jasad renik PRG,sehingga tidak akan menimbulkan risiko terhadap lingkungan.

KESIMPULAN

1. Vaksin Ingelvac^® CircoFLEXbersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik kelingkungan.Hal ini karena didalam sediaan produk akhirsudah tidak mengandung Baculovirus rekombinan ORF2 PCV2, melainkan protein murni dari ORF2 PCV2 yang bersifat inaktif.
2. Berdasarkan kajian stabilitas fenotipe dan genotipe jasad renik PRG dalam vaksinIngelvac^® CircoFLEX dinyatakan stabil.
3. TTKH PRG bidang keamanan lingkungan menilai bahwa vaksin Ingelvac^® CircoFLEX yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan.
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan terhadap vaksin Ingelvac^® CircoFLEX perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta memusnahkan vaksin Ingelvac^® CircoFLEX yang berada di wilayah teritori Indonesia.
6. Vaksin Ingelvac^® CircoFLEX tidak boleh digunakan sebagai vaksin babi sampai memperoleh ijin aman lingkungan.

PUSTAKA

Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Summary Information Format: Part I and II for recombinant BaculovirusContaining Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) open reading frame 2 (ORF2). Biological Research and Development, BIV, IOWA-USA. 2004.

Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral Identity Testing, PCV2 ORF2 Baculovirus. Reporting Document. Boehringer Ingelheim Vetmedica, Biological Research & Development. Ames. 2004.

Eichmeyer M, Nitzel G, Schaeffer M. 2010. Patent Application Publication No.US 7,700,285 B1 tanggal 20 April 2010. United State Patent.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.2013.NCBI Blast: Nucleotide Sequence (756 letter).

ThiemSM, Cheng XW. 2009. Baculovirus Host-Range. Virologica Sinica, 24 (5):436-457.

Vaughn E, Schaeffer M. 2011. US Patent Applications Publication Number:  US 2011/0020394 A1, tanggal 27 Januari 2011.

Volkman LE, Goldsmith PA. 1983. In Vitro Survey of Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Interaction with Non–target Vertebrate Host Cells. Applied and Environmental Microbiology, Mar. 1983, p. 1085-1093.