Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaxxitek HVT+IBD

  1. Pendahuluan

Vaksin Vaxxitek HVT+IBD adalah vaksin produk rekayasa genetika (PRG) untuk pengendalian dan penanggulangan penyakit Infectious Bursal Disease (IBD) dan Marek’s Disease (MD) yang sangat virulen pada ayam. Vaksin ini diproduksi oleh Merial Select, Inc., USA, yang akan diedarkan oleh PT Romindo Primavetcom. Master Seed vaksin ini adalah virus HVT+IBD (vHVT-013-069) yang merupakan  jasad renik PRG virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC 126 dengan sisipan gen VP2 virus IBD.

Vaksin PRG Vaxxitek HVT+IBDV telah terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale di berbagai negara yaitu di Eropa (2002), USA (2004), Brazil (2005), EMEA (2005), Argentina (2006), Elsavador (2006), Peru (2006), Venezuela (2006), Bolivia (2007), Kolumbia (2007), Guatemala (2007), Filipina (2007), Thailand (2007), Ukraina (2007), Kanada (2008), Dominika (2008), Ekuador (2008),  Maroko (2008), Meksiko (2008), Rusia (2008), dan Malaysia (2013).

Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik,  dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No. 25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin PRG Vaxxitek HVT+IBD. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas sifat genetik yang telah direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik, dan kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG untuk vaksin terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan dibawah ini.

 

  1. Informasi Jasad Renik

II.1. Deskripsi Umum Jasad Renik

Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi vaksin Vaxxitek HVT+IBD adalah rekombinan Herpes Virus of Turkey strain FC 126 yang disisipi gen VP2 Virus IBD strain 52/70 Faragher sebagai gen donor (Aly et al., 2012; Merial Select., 2006).

 

II.2. Informasi Sifat Genetik Jasad Renik

Tetua jasad renik PRG adalah virus HVT strain FC-126, tidak patogen pada ayam bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit MD. Sebagai donor gen VP2 adalah virus IBD strain 52/70 Faragher yang disisipkan di posisi UL 55 sehingga tidak menginaktivasi virus HVT, akan tetapi mengekspresikan protein VP2. Jumlah kopi gen yang disisipkan sebanyak 1 gen VP2. Ekspresi gen VP2 inilah yang akan menginduksi respon kekebalan terhadap virus IBD. (Bublot., 1999; Analytical Dossier Merial., 1999)

Master seed virus rekombinan HVT+IBD telah diuji stabilitas genetiknya secara in vitro pada Chicken Embryo Fibroblast (CEF) 10x pasase dan secara in vivo dengan 5 dan 9 x pasase balik pada ayam Specific Pathogen Free (SPF). Hal ini dapat terlihat dari data pengujian yang tercantum dalam laporan “In Vitro Genetic stability of the HVT 013-69 Recombinant virus dan In Vivo Genetic stability of the HVT 013-69 Recombinant virus (Bublot., 1998a; Bublot., 1998b; Analytical Dossier Merial., 1999).

 

 

II.3. Metoda Konstruksi Genetik

Pembuatan rekombinan plasmid donor gen VP2

 

Konstruksi Plasmid Insersi

Untuk melakukan insersi gen VP2 ke dalam genom HVT disusun plasmid insersi untuk locus 1 intergen. Fragmen I yang merupakan fragmen BamHI–BamHI genom HVT (Strain FC 126) di klon ke dalam tapak BamHI dari pBR322. Hasil klon ini menjadi plasmid pRD069. Fragmen BamHI–EcoRI (2.674 bp) dari pRD069 di sub-clone ke pBS II-SK+ (Stratagene Inc.) menjadi pEL039.  Plasmid pEL039 didigesti dengan BamHI dan PstI untuk menghasilkan fragmen A (992 bp). Fragmen 417 bp diperoleh dari hasil PCR pada plasmid pEL039 dengan menggunakan Primer EL102 dan Primer EL161, mengandung tapak SalI. Hasil PCR ini didigesti dengan PstI dan SalI untuk menghasilkan fragmen B (225 bp). Fragmen A dan fragmen B diklon ke dalam pBSII–SK+ untuk menghasilkan pEL 077 (4.163 bp).  Fragmen 923bp yang diperoleh dan hasil digesti pEL039 dengan SacI dan BglII diklon ke dalam tapak SacI–BglII dari pBSII–SK+ menjadi pEL 083 (3.848 bp). Fragmen 707 bp diperoleh dari hasil PCR plasmid pEL039 dengan menggunakan Primer EL147 dan Primer EL162. Hasil PCR ini diklon ke sistem vektor kloning PCR II (Invitrogen). Fragmen BstBI-SalI (468 bp) diperoleh dari hasil digesti plasmid rekombinan ini dan diklon ke plasmid pEL 083 dan menghasilkan plasmid pEL 065 (4.133 bp). Fragmen XhoI-SalI (832 bp) diperoleh dari hasil digesti pEL077 dengan enzim XhoI dan SalI dan diklon ke tapak XhoI–SalI dari pEL065 untuk menghasilkan lokus intergen 1 plasmid insersi pEL079 (Bublot., 1999).

 

Kloning promotor IE dari MCMV

Plasmid pAMB 33 yang mengandung promotor IE dari MCMV didigesti dengan enzim PstI. Fragmen PstI-PstI (2.286 bp) diisolasi dan diinsersikan ke vektor pBSII-SK+ untuk menghasilkan pCD004 (5.250 bp). Plasmid pCMVb (Clontech) didigesti dengan enzim SalI dan SmaI, menghasilkan fragmen 3.682 bp yang mengandung gen LacZ dan tapak poliadenilasi dari SV40. Fragmen ini diinsersikan ke tapak SalI-EcoRV dari pBSII-SK+ untuk menghasilkan pCD 002 (6.622 bp). Plasmid pCD 004 didigesti dengan enzim HpaI dan PstI untuk menghasilkan fragmen sebesar 1.388 bp, yang kemudian diinsersikan ke plasmid pCD002 menjadi plasmid pCD009 (8.004 bp). Plasmid ini mengandung promotor IE dari MCMV diikuti dengan gen LacZ dan signal poliodenilasi dari SV40 (Bublot., 1999).

 

Kloning Gen VP2 virus IBD

Kloning sekuen VP2 IBDV sudah dilakukan oleh Merial tahun 1989 / 1990 dalam bentuk plasmid rekombinan pEL024.  Plasmid rekombinan pBSII-SK+ mengandung seluruh open reading frame VP2 (menyandi 453 asam amino) yang diapit oleh tapak NotI. Sekuen gen VP2 IBDV ini dapat diakses dari GenBank Accession Number D00869 (NCBI).

 

Konstruksi Kaset ekspresi gen VP2 IBDV

Plasmid pEL024 didigesti dengan enzim NotI untuk memperoleh fragmen NotI–NotI (1.405 bp) yang mengandung seluruh gen VP2. Fragmen ini diinsersi ke tapak NotI dan plasmid pCMVb untuk menjadi plasmid pEL026. Plasmid ini didigesti dengan enzim XmnI, EcoRI dan SalI untuk memperoleh fragmen EcoR-SalI (2.442 bp). Fragmen ini diinsersi ke dalam pBSII-SK menjadi plasmid pEL027 yang mengandung kaset ekspresi VP2 (HCMV – IE promotor, gen VP2 IBDV dan signal poliadenilasi SV40) (Bublot., 1999).

 

Konstruksi plasmid donor final

Plasmid pEL070 didigesti dengan enzim XmnI, EcoRI dan SalI (3.037 bp) yang mengandung kaset ekspresi MCMV-IE/IBDV – VP2. Fragmen ini diligasi dengan plasmid pEL079 untuk menghasilkan pEL098 (Bublot., 1999).

 

Pembuatan virus rekombinan vHVT 013

Virus rekombinan vHVT013 dihasilkan dari rekombinasi homologous antara plasmid pEL098 dengan cDNA HVT strain FC 126 melalui cotransfection ke dalam kultur primer CEF (Bublot., 1999).

 

II.4. Karakter Modifikasi Genetik

Virus HVT+IBD rekombinan adalah virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC-126 yang disisipi gen VP2 virus Infectious Bursal Disease (IBD) strain 52/70 Faragher. Modifikasi genetik yang berupa penyisipan gen VP2 virus IBD ke genom HVT tidak mempengaruhi virulensi HVT sebagai tetuanya bahkan protein gen VP2 tersebut dapat memproteksi terhadap infeksi IBD. Rekombinan HVT+IBD bersifat stabil yang dibuktikan dengan uji Southern blot dan PCR setelah pasase secara in vitro dan in vivo (Merial Select., 2006).

 

II.5. Kemungkinan terjadinya ketidakstabilan gen yang disisipkan sehingga dapat dipindahkan ke organisme lain.

Gen VP2 yang disisipkan ke dalam virus rekombinan HVT+IBD bersifat stabil sesuai dengan penjelasan yang terdapat pada butir II.2. Untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen donor (gen VP2) ke organisme lain, maka telah dilakukan analisis BLAST nukleotida dari gen VP2 virus IBD strain 52/70 dengan nomor  akses D00869. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen VP2 tersebut tidak memiliki homologi dengan sekuen gen organisme lainnya oleh karena itu pemindahan gen ke organisme lainnya tidak memungkinkan.

 

II.6. Kesimpulan.

Gen interes (gen VP2 dari virus IBD) yang disisipkan ke dalam virus rekombinan HVT dapat diekspresikan dengan baik. Ekspresi protein heterolog ini tidak merubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit Marek dan IBD. Virus rekombinan HVT+IBD mengandung satu kopi gen VP2 yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip. Tidak ada kemungkinan penyebaran / pemindahan gen VP2 yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT+IBD) ke organisme lain.

 

III. Informasi Keamanan Lingkungan

III.1.Kemampuan Penyebaran Jasad Renik

Jasad renik PRG dalam Vaxxitek HVT+IBD mempunyai sifat yang sama dengan virus HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan ke dalam ekskreta hewan sehingga tidak menimbulkan kemungkinan risiko terhadap lingkungan (Goutebroze, 1998 Research Report 97.361 Safety, Spread of the Vaccinal and Parental Strains from Chicken to Chicken and 98.183 Safety, Spread of the Vaccinal and Parental Strains from Chicken to Turkey).

 

III.2. Informasi Cakupan Inang Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin

Tetua virus PRG HVT+IBD adalah virus HVT strain FC-126 yang termasuk dalam famili Herpesviridae dan subfamili Alphaherpesvirus. Inang alami tetua HVT adalah ayam, burung puyuh dan kalkun.

 

III.3. Informasi Kajian Molekuler.

Sifat genetik yang direkayasa adalah penyisipan gen VP2 virus IBD strain 52/70 Faragher ke dalam HVT pada posisi UL 55. Penyisipan ini tidak mengubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberi perlindungan terhadap penyakit Marek dan IBD. Virus rekombinan HVT+IBD mengandung satu kopi gen VP2 yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip. Pemindahan gen VP2 yang telah disisipkan ke dalam virus HVT tidak dimungkinkan karena tidak ada homologi dengan sekuen genom organisme lain sehingga aman terhadap lingkungan. Modifikasi genetik dapat dianalisis dengan salah satu dari metoda Southern Blot dan/atau PCR. Sedangkan fenotip dari rekombinan ini dapat dicirikan dengan metoda plaque for double imunofluorescence (Cleuziat, 1999 Phenotypic stability after 3 and 8 passages in vitro) (Cleuziat., 1999).

 

III.4. Kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG vaksin terhadap lingkungan.

Hasil analisis BLAST menunjukkan bahwa nukleotida gen VP2 tidak memiliki homologi sekuen genom dengan organisme lain, sehingga tidak dimungkinkan transfer gen tersebut ke organisme lain. Vaksin PRG Vaxxitek HVT+IBD tidak membentuk spora karena tetua dari vaksin ini adalah termasuk dalam golongan virus. Virus PRG Vaxxitek HVT+IBD tidak diekskresikan oleh hewan yang divaksin sehingga tidak berpotensi menyebar ke hewan non target. Oleh karena itu tidak ada kemungkinan risiko terhadap lingkungan.

 

KESIMPULAN

  1. Vaksin Vaxxitek HVT+IBD bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik PRG ke lingkungan. Hal ini karena jasad renik PRG dalam sediaan vaksin Vaxxitek HVT+IBD tidak diekskresikan dari hewan yang divaksin ke lingkungan.
  2. Fenotip dan genotip jasad renik PRG dalam vaksin Vaxxitek HVT+IBD bersifat stabil.
  3. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan merekomendasikan bahwa vaksin Vaxxitek HVT+IBD yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan. Jika dikemudian hari ditemukan data dan atau informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan terhadap vaksin Vaxxitek HVT+IBD perlu dikaji kembali. Apabila setelah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan serta lingkungan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin Vaxxitek HVT+IBD yang berada di wilayah teritori Indonesia.
  4. Vaksin Vaxxitek HVT+IBD tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam sampai memperoleh ijin aman lingkungan.

 

 

 

PUSTAKA

 

  1. R. and Susan. S., 2012. Laboratory Evaluation of Live Recombinant HVT-IBD Vaccine. Report and Opinion, 4: (4).
  2. Merial Select, Inc., 2006 Administrative Data and Technical Dossier.
  3. Bublot., 1999. Amendment No1 of 05/01/00. Construction of Recombinant vHVT 013-69 virus. , Merial Laboratorie de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Merieux, 69007 Lyon, France.
  4. Analytical Dossier Merial Select Inc. RMB 533 (Vaxxitek HVT+IBD). No.922/EN-01, Dec. 1999. Part II.H. Data related to the environmental risk assesment for products containing or consisting of GMOs. ANALYTICAL DOSSIER. Merial 17, rue Bourgelat 69002 LYON.
  5. Bublot, 1998a. 98.132. RMB533 vHVT 013-69 recombinant virus. In Vitro Genetic stability of the vHVT 013-69 Recombinant Virus (HVT recombinant Virus expressing the VP2 gene of the Gumboro Disease Virus analyzed by Southern Blot and PCR) after 10 passages in chickens Embrio Fibroblast Cell Culture , Merial Laboratorie de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Merieux, 69007 Lyon.
  6. Bublot., 1998b. report 98.133. RMB533 vHVT 013-69 recombinant virus. In Vivo Genetic Stability Analysis of Recombinant virus vHVT 013-69 (HVT recombinant Virus expressing the VP2 gene of the Gumboro Disease Virus analyzed by Southern Blot and PCR) After 5 and 9 Passages in Chickens (target Species) , Merial Laboratorie de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Merieux, 69007 Lyon.
  7. NCBI (National Center for Biotechnology Information) Hasil analisis GenBank VP2 IBDv Strain 52/70 Faragher. ncbi.nlm.nih.gov
  8. Cleuziat, 1999. Report 99.0262. R. RMB 533 Vaccine. Recombinant virus vHVT 013-69, Phenotypic Stability After 3 and 8 Passage in Vitro. Merial Laboratorie de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Merieux, 69007 Lyon, France.

 

 

Write a Comment

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan.